NIPT

Neinvazívne prenatálne testovanie (NIPT) sa vykonáva s cieľom potvrdiť alebo vylúčiť u plodu výskyt sledovaných chromozómových porúch.

Odborné informácie

Aké poruchy zisťuje TRISOMY test, TRISOMY test XY  a TRISOMY test +?

Vývoj NIPT vo svete a na Slovensku:

1997objav voľnej cirkulujúcej DNA plodu
1997neinvazívne určenie pohlavia plodu prostredníctvom detekcie Y-chromozómových sekvencií
1998kvantitatívna analýza voľnej fetálnej DNA v maternálnej cirkulácii
1998neinvazívne určenie RhD statusu plodu
1999preukázané rýchle odbúranie voľnej fetálnej DNA po pôrode
2000neinvazívny DNA test na monogénne dedičné ochorenie (achondroplázia)
2008pilotné štúdie na neinvazívne stanovenie aneuploidie plodu
2009prvá aplikácia a potvrdenie konceptu, že sekvenovanie novej generácie (NGS) umožňuje detekciu trizómie 21 plodu
2010detailne charakterizovaná rozdielnosť fragmentácie maternálnej a fetálnej DNA
2010neinvazívne stanovená podrobná genomická mapa plodu
2011dostupnosť komerčných testov NIPT
2012neinvazívne stanovená úplná genomická sekvencia plodu
2015zavedenie prvého, na Slovensku vyšetrovaného, neinvazívneho skríningu DNA plodu z krvi matky do klinickej praxe – TRISOMY test
2016rozšírenie TRISOMY testu o jeho plusový variant, ktorý dokáže stanoviť viac chromozómových porúch

Princíp testu

Princíp testu

Vyšetrenie využíva celogenómovú sekvenačnú analýzu voľnej fetálnej DNA izolovanej z periférnej krvi tehotnej. Dáta získané sekvenačnou analýzou s nízkym pokrytím sa vyhodnotia vlastným výpočtovým algoritmom a sú verifikované podľa postupu publikovaného Bianchi a kol. (2012). *

 

* Bianchi DW a kol. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012 May; 119 (5):890 – 901.

Klinický význam

Cieľom TRISOMY testu je zachytiť prípady častých trizómií plodu s vysokou senzitivitou a špecifickosťou už v raných štádiách tehotenstva a minimalizovať tak nutnosť absolvovať amniocentézu,ktorá so sebou nesie určité riziko potratu vyvolaného vykonaním odberu plodovej vody.

Napriek veľmi vysokej senzitivite a špecifickosti záchytu sledovaných trizómií je TRISOMY test skríningové vyšetrenie, nie diagnostické.

V praxi to znamená, že každý pozitívny výsledok vyšetrenia TRISOMY testu musí byť následne potvrdený invazívnym odberom genetického materiálu plodu (odber plodovej vody alebo choriových klkov) a genetickým vyšetrením takto získanej vzorky (pozri interferencie).

Negatívny výsledok TRISOMY testu vylúči prítomnosť trizómií 21, 18 a 13 u plodu. Negatívny výsledok testu spravidla nie je potrebné validovať zo vzorky získanej invazívnym spôsobom (pozri interferencie).

 

Indikujúci lekár

TRISOMY test indikuje lekár so špecializáciou v gynekológii a pôrodníctve a v lekárskej genetike.

TRISOMY test XY indikuje lekár so špecializáciou v gynekológii a pôrodníctve a v lekárskej genetike.

TRISOMY test + indikuje lekár so špecializáciou v lekárskej genetike.

Senzitiva a špecifickosť

NIPT testy sa vo všeobecnosti vyznačujú vysokou senzitivitou a špecifickosťou. Vyšetrenia fetálnej DNA, poskytované rôznymi laboratóriami, sa líšia určitými technickými detailmi. S tým súvisia rozdiely v dosahovaných kľúčových parametroch NIPT testov, a to predovšetkým:

  • v percente zachytených trizomických plodov – DetectionRate (DR)
  • v percente falošne pozitívnych výsledkov – False PositiveRate (FPR)

Senzitivita NIPT na trizómiu 21 a trizómiu 18 sa pohybuje podľa konkrétneho laboratória a typu testu v rozmedzí 90 – 100 % pri menšej ako 0,1 % falošnej pozitivite výsledkov.*

Senzitivita NIPT testov na trizómiu 13 je nižšia (79 – 92 %). Dôvodom prípadného zlyhania NIPT môžu byť technické príčiny a tiež veľmi zriedkavý výskyt gravidít s trizómiou 13 v populácii. Mieru falošnej pozitivity možno očakávať na úrovni menšej ako 0,1 %.*

* – DOI: 10.1056/nejmoa1407349#t=article

NIPT – detekcia chromozómových
aneuploidií – spoľahlivosť

TrialDown syndrome
DR (n (%))FPR (n (%)
Chiu et al., 201186/86 (100)3/146 (2,1)
Ehrich et al., 201139/39 (100)1/410 (0,24)
Palomaki et al., 2011209/212 (98,6)3/1471 (0,20)
Bianchi et al., 201289/90 (98,9)0/410 (0,00)
Sparks et al., 201236/36 (100)1/123 (0,81)
Ashoor et al., 201250/50 (100)0/297 (0,00)
Norton et al., 201281/81 (100)1/2888 (0,03)
Total590/594 (99,3)9/5745 (0,16)

TRISOMY test
senzitivita a špecifickosť

n = 203Senzitivita95 % CIŠpecifickosť95 % CInP
T21> 99 %90,97-100 %> 99 %97,78-100 %39
T18> 99 %*> 99 %*5
T13> 99 %*> 99 %*2

n – celkový počet vzoriek vo validačnej štúdii
nP – počet pozitívnych vzoriek
CI – Confidence Interval
* 95 % CI pre nízky počet vzoriek nehodnotený

Počet vzoriek bez výsledku pri NIPT: < 5 %.
Počet vzoriek bez výsledku pri TRISOMY teste: < 1 %.

 

Všetky do štúdie zaradené trizomické vzorky 21, 18 a 13 boli pomocou TRISOMY testu úspešne detegované.

Unikátna metodika prípravy vzorky krvi

Špeciálnou súčasťou laboratórneho postupu pri vyšetrení TRISOMY test je unikátna procedúra, ktorá zabezpečuje zvýšenie podielu fetálnej DNA oproti východiskovému stavu. Je to vďaka využitiu fyzikálnej odlišnosti fetálnej DNA a DNA pochádzajúcej od matky. Vďaka tomuto kroku laboratórium dosahuje po spracovaní vzoriek TRISOMY testu priemerný podiel fetálnej DNA 16 % (priemerný podiel fetálnej DNA v zverejnených štúdiách sa pohybuje v rozmedzí 10 – 13 %). Ešte dôležitejší je však fakt, že v súbore vzoriek spracovaných touto špeciálnou metodikou nebol nikdy dosiahnutý menší podiel fetálnej DNA plodu ako 7,5 %, čo výrazne znižuje riziko zlyhania testu z dôvodu nízkeho obsahu fetálnej frakcie DNA vo vyšetrovanej vzorke.

Na základe charakteristiky metódy prípravy, analýzy a hodnotenia vzoriek od tehotných so zdravým plodom a tehotných s plodom s trizómiou chromozómu 21, použitej v rámci našej validačnej štúdie, je možné štatisticky odhadnúť výskyt falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov v závislosti od podielu fetálnej DNA v krvi tehotnej. V nadväznosti na dostupné informácie je známe, že výška podielu fetálnej DNA v krvi tehotnej je individuálna a výskyt vzoriek s nízkou fetálnou frakciou (< 4 %) bol zistený u menej ako 5 % tehotných (priemerný podiel fetálnej DNA sa pohybuje na úrovni 14,5 %). ***

Z výsledkov nami realizovanej validačnej štúdie, pri ktorej bolo analyzovaných 164 vzoriek od tehotných s normálnym plodom a 39 vzoriek od tehotných s plodom s potvrdenou trizómiou chromozómu 21, vyplynulo, že priemerný podiel fetálnej DNA vo vzorkách získaných od tehotných s plodom s trizómiou chromozómu 21 dosahoval 16 % (modrá krivka na grafe 1). Pri takomto podiele fetálnej DNA v maternálnej cirkulácii je pravdepodobnosť, že výsledok analýzy bude neinformatívny, ~ 1:3×1013 a pravdepodobnosť, že dosiahnutý výsledok bude falošne negatívny (teda nesprávny), nižšia ako 1 : 9×1018.

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf1

Pri vzorke s najnižším v našej štúdii pozorovaným podielom fetálnej DNA dosahujúcim 7,5 % (červená krivka) je pravdepodobnosť výskytu neinformatívneho výsledku ~ 1 : 15 a pravdepodobnosť výskytu falošne negatívneho (teda nesprávneho) výsledku nižšia ako 1 : 740.

Z analýzy výsledkov vzoriek od tehotných so zdravým plodom (modrá krivka) vyplýva, že pravdepodobnosť výskytu neinformatívneho výsledku je ~ 1 : 161 a pravdepodobnosť výskytu falošne pozitívneho (teda nesprávneho) výsledku je nižšia ako 1 : 30 000.

Na minimalizáciu rizika získania falošne negatívnych, resp. falošne pozitívnych výsledkov v dôsledku prirodzene sa vyskytujúcich prípadov tehotenstiev s nízkou fetálnou frakciou, je pri vyhodnotení výsledkov analýz použitá zóna definujúca neinformatívne výsledky – tzv. šedá zóna. Táto je na grafe prezentovaná šedým podfarbením (graf 2). Ak sa vzorka po analýze nachádza v tejto oblasti, je potrebné vzorku opätovne analyzovať. V tejto súvislosti sa vyžaduje opakovanie odberu krvi tehotnej v dvojtýždňovom intervale.

*** Hudecova I, Sahota D, Heung MM, Jin Y, Lee WS, Leung TY, Lo YM, Chiu RW. Maternal plasma fetal DNA fractions in pregnancies with low and high risks for fetal chromosomal aneuploidies. PLoS One. 2014 Feb 28;9(2):e88484. doi: 10.1371/journal.pone.0088484

Vyhodnotenie dát pomocou vlastného algoritmu

Dáta jednotlivých NIPT testov, získané celogenómovou sekvenačnou analýzou voľnej fetálnej DNA, sú vyhodnocované pomocou náročných matematických modelov a líšia sa v závislosti od použitej metodiky a laboratória. Cieľom hodnotenia je výpočet tzv. Z-skóre (graf 4).

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf4

Vlastný zdokonalený algoritmus hodnotenia dát TRISOMY testu umožňuje dosiahnutie vyššej strednej hodnoty Z-skóre v hodnotených vzorkách oproti konkurenčným metódam výpočtu.

Vyššia stredná hodnota Z-skóre v pozitívnych vzorkách, dosahovaná zdokonaleným algoritmom pri hodnotení TRISOMY testu, sa automaticky premieta do presnejšej distribúcie negatívnych a pozitívnych hodnôt výsledkov vyšetrení a umožňuje zmenšenie tzv. šedej zóny (Area of Overlap), keď nie je možné o pozitivite či negativite výsledku vyšetrenia jednoznačne rozhodnúť.

Interferencie

Vzhľadom na to, že TRISOMY test, TRISOMY test XY  a TRISOMY test + sú skríningové a nie diagnostické vyšetrenie, môžu sa vyskytnúť falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky. Pozitívny výsledok analýzy je potrebné diagnosticky potvrdiť aktuálne dostupnou diagnostickou metódou, teda následnými genetickými vyšetreniami plodovej vody.

Negatívny výsledok nie je absolútnym vylúčením žiadnej z testovaných trizómií. Príčinou môže byť prirodzene sa vyskytujúci fenomén mozaicizmu placenty, syndrómu miznúceho dvojčaťa, bodových mutácií, inaktivácie génov alebo iných typov genetických, resp. epigenetických mechanizmov, alebo prítomnosť cudzej DNA v krvi matky.

V určitom malom percente vzoriek nie je možné NIPT test ukončiť jednoznačným výsledkom, teda takýto test považujeme za neúspešný.**** Príčina zlyhania môže byť technická alebo biologická. Hlavnou technickou príčinou zlyhania testu býva nesprávne vykonaný odber krvi alebo transport vzorky do laboratória v nevyhovujúcich podmienkach.

Najčastejším biologickým dôvodom neúspešnosti testu je predovšetkým znížený podiel fetálnej DNA v získanej vzorke v porovnaní s obsahom materskej DNA. V prípade, že je podiel fetálnej DNA v získaných vzorkách nižší ako 4 %, výrazne klesá spoľahlivosť testu (graf 5). Podľa výsledkov publikovaných štúdií je možné očakávať výskyt vzoriek s nízkym podielom fetálnej DNA frakcie na úrovni 1,5 – 6,1 %.

Výsledky získané hodnotením vzoriek s obsahom fetálnej DNA pod 4 % nie sú vhodné na interpretáciu.

middlebox_image-pre-lekarov--odborne-informacie--graf5

**** M. M. Gil, M. S. Quezada, R. Revello, R. Akolekar, and K. H. Nicolaides, „Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis,“ Ultrasound Obstet. Gynecol. 45 (3), 249-266 (2015)